고려대학교 물리학과

형광물질 없이 생체 조직 속 신경망 꿰뚫어본다

- 빛의 파면왜곡을 극복한 고심도 영상기술로 광학현미경의 한계 뛰어넘어 -

▲ 왼쪽부터 이번 연구에 참여한 최원식 교수(교신저자), 김문석 (공동 제 1저자), 조용현(공동 제 1저자)

기초과학연구원(IBS, 원장 김두철) 분자 분광학 및 동력학 연구단(단장 조민행) 최원식 부연구단장 연구팀은 초고속 스캐닝 홀로그램 현미경 기술을 개발했다. 이를 이용해 비침습, 비표지 방식으로 살아있는 제브라피쉬(zebrafhis)의 중추신경계 신경망 구조를 고해상도로 이미징할 수 있음을 증명하였다. 이러한 기술은 뇌신경과학 뿐 아니라 다양한 의생명융합 연구와 진단기술에 활용될 것으로 기대된다.

생체조직은 다양한 세포들로 이루어진 복잡한 내부 구조와 굴절률 분포로 인하여 진행하는 빛의 파면을 왜곡시킨다. 이러한 파면왜곡은 광학적 진단 및 광치료 기술의 유효 깊이를 제한하는 근본적인 원인이다. 따라서 파면왜곡을 극복하는 것은 광학영상에서 필수적인 중요한 문제이다.

파면왜곡을 극복하는 방법으로 적응광학 분야에서 파면측정 기술이나 파면제어 기술이 활발히 연구되고 있다. 특히 살아있는 상태로 고심도 생체영상을 획득하기 위해서는 특정 깊이를 선택적으로 빠르게 측정하는 것이 중요하다. 그러나 기존에 개발된 적응광학 기술들은 파면측정 또는 파면제어를 반복적으로 수행해야 하기 때문에 영상속도가 느려져 복잡한 파면왜곡을 보정하기에는 어려움이 있었다.

이러한 문제를 해결하기위해 IBS 분자 분광학 및 동력학 연구단 최원식 부연구단장 연구팀은 초고속 스캐닝 홀로그램 현미경을 개발했다. 기존 시분해 홀로그램 현미경에 비하여 영상 획득 속도를 수십 배 이상 향상시켰고, 하드웨어적인 처리과정 없이 파면왜곡 보정 알고리즘을 통하여 초점의 광신호를 백배 이상 향상시킬 수 있음을 보였다.

시분해 홀로그램 현미경은 간섭계 방식으로 물체의 광신호와 참조광의 간섭신호를 기록한다. 이러한 광간섭신호를 기록하기 위해서는 물체광과 참조광 펄스면을 일치시켜야 한다. 기존의 참조광이 고정된 간섭계 방식의 홀로그램 현미경의 경우 샘플빔의 입사각을 거울로 회전하여 스캐닝하게 되면 간섭신호는 수 마이크로 영역으로 제한되어 대면적 영상을 얻는 것이 불가능하다. 샘플빔과 참조광의 펄스면을 맞추기 위한 방법으로 액정기반의 공간광변조기를 사용하여 샘플의 입사파를 변조하는 방법이 있으나, 공간광변조기의 제어속도가 느리기 때문에 생체영상에 어려움이 컸다.

연구진은 이러한 문제를 해결하고 대면적 간섭신호를 얻기 위하여 샘플빔과 참조광을 동조시켜 각도를 회전하는 새로운 방식의 초고속 스캐닝 홀로그램 현미경 기술을 개발하였다. 샘플빔과 참조광을 동조시킨 초고속 스캐닝 현미경은 기존 방법보다 수십 배 이상 영상획득 속도를 향상시켰다. 더불어 반복적인 하드웨어 처리과정 없이 반사행렬을 수치적으로 분석하는 방식의 파면왜곡 보정 알고리즘을 통해 초점의 광신호를 백배 이상 증가시켰다.

연구진은 초고속 스캐닝 홀로그램 현미경을 이용하여 형광 표지 인자를 사용하지 않고, 살아있는 제브라피쉬의 후뇌부에서 고해상도의 뇌신경망 영상을 얻을 수 있음을 보였다. 기존의 광학현미경 기술은 주로 부화한지 1주일 이내의 어린 제브라피쉬에서 형광 표지 인자를 사용하여 신경섬유 구조를 확인할 수 있었다. 이에 반해 연구진은 수 주 이상 발달한 개체에서 비표지 방식으로 중추신경계의 신경망 영상을 고해상도로 획득하였다.

최원식 부연구단장은 “이번 연구를 통해 기존 광학 현미경 기술의 깊이를 한 단계 뛰어넘었다”며 이러한 방식이 향후 뇌신경과학 뿐 아니라 다양한 의생명 융합연구와 나노스케일의 측정이 필요한 산업분야에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대한다고 밝혔다.

이번 연구결과는 국제학술지 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications, 5-year IF 13.811) 온라인판에 7월 17일 게재됐다.

< 그림 설명 >

[그림 1] 시분해 초고속 홀로그램 현미경의 원리. (a) 시분해 초고속 홀로그램 현미경의 모식도로 스캐닝 거울을 이용해 물체를 조명하는 입사파와 참조광을 동시에 바꾸어가며 되돌아나온 간섭무늬를 기록한다. 기존에 간섭계 방식의 현미경은 참조광을 고정시킨채 샘플빔만 스캐닝 하기 때문에 그러한 방식으로 넓은 면적에서 반사된 광신호를 기록할 경우 (b)와 같이 샘플빔의 temporal front가 달라지기 때문에 일부 제한된 영역에서만 간섭무늬가 기록된다. 따라서 기존 간섭계 방식으로 시분해 광원을 사용해 고속 스캐닝 홀로그램 현미경을 만드는데 어려움이 있었다. 샘플빔과 참조광을 동시에 스캐닝하는 새로운 방식의 경우 (c)와 같이 temporal front를 동조시킴으로써 모든 면적에서 간섭무늬를 기록할 수 있다.

[그림 2] 생체조직에서 일어나는 파면왜곡 보정기술. 광학간섭 현미경(optical coherence microscopy) 영상을 이용하여 살아있는 zebrafish의 후뇌부와 귀를 연결하는 부위를 관찰할 때 (a)와 같이 뿌연 섬유다발 구조가 보인다. (d)와 같이 부화한지 21일된 zebrafish의 경우 후뇌부를 덮는 부위에 비늘이 두껍게 형성되어 그 내부를 관찰하는데 어려움이 크다. (a)의 흰색 점선과 같이 영역을 나누어 각 영역에서 일어나는 빛의 파면왜곡을 수치적으로 찾아낸 후 (c), 이를 위상지도로 표현한 결과 파면왜곡이 위치에 따라 영역 별로 매우 복잡하게 일어나는 것을 확인하였다. 이러한 파면왜곡을 보정하면 (b)와 같이 얽혀있는 신경계의 섬유구조가 선명히 드러난다. (c)와 같이 복잡한 파면왜곡은 고차광학수차 모드를 포함하여 기존의 적응광학기술로 극복하기에 어려움이 컸다. 시분해반사행렬을 이용한 방법은 (e)와 같이 수치적으로 매질의 광특성을 정량화할 수 있고 이로부터 물체정보를 가진 단인산란파 신호를 추출하여 각도별 위상변화를 찾아내어 매질의 파면왜곡을 찾아 시분해반사행렬을 보정할수 있다(f). 이 때 현미경 영상의 성능을 정량화하는 지표로 point spread function을 분석해 보면, 파면왜곡을 보정하기 전(h)에 비하여 파면왜곡을 보정한 후(i)에 초점 신호의 크기가 52배(j) 증가한 것을 확인하였다.

[그림 3] 살아있는 zebrafish에서 후뇌부 3차원 신경망영상. 광학간섭 현미경(optical coherence microscopy) 영상을 이용하여 살아있는 zebrafish의 후뇌부와 귀를 연결하는 부위를 관찰할 때 (a)와 같이 뿌연 섬유다발 구조가 보인다. (d)와 같이 부화한지 21일된 zebrafish의 경우 후뇌부를 부화한지 10일된 zebrafish에서 측정한 후뇌부 3차원 뇌신경망 지도(a). 깊이별로 후뇌부의 구조와 세포분포 중추신경계를 이루는 신경섬유를 고해상도로 관찰가능하다(b-e). 깊이 영역을 projection하여 관찰해보면 일반적으로 사용되는 공초점 현미경을 이용한 형광영상(f)과 반사영상(h)과 비교하여 월등히 선명한 신경망 구조를(h) 볼 수 있다. zebrafish의 발달단계에 따른 신경계 변화를 관찰가능하다(h:10일, i:6일).